Реакция антиген-антитяло. Механизъм, фази. Видове имунни диагностични реакции-аглутинация, преципитация, неутрализация, РСК, имунофлуоресцентен метод, имуноензимен метод, радиоимунен метод.
Реакция Антиген-Антитяло.
Антителата се свързват специфично със съответните антигени, което се съпровожда с неутрализирането или елиминирането им Ин Витро. Така се осигурява защитата на макроорганизма от инфекциозни причинители и техните токсични продукти. Използване на реакция антиген-антитяло (серологична реакция) има диагностично значение.
Взаимодействието между антигена и антитялото протича в две фази – фаза на сензибилизиране, която представлява специфичното им свързване без видими промени, и фаза на визуализиране, която е в зависимост от физико-химичните свойства на взаимодействащите компоненти. През първия етап се осъществява разпознаването на антигена и свързването му със специфичните антитела, в резултат на което се образува комплекс антиген-антитяло. През втората фаза специфичният комплекс антиген-антитяло взаимодейства с неспецифичните фактори на средата, в която протича реакцията. Втория етап е бавен и се характеризира с оформяне на пространствена “решетка” от редуващи се антигени и антитела.
Реакция АГЛУТИНАЦИЯ
Представлява слепване и утаяване на бактерии или други копроскулярни (неразтворими) частици при свързването им със специфични антитела в присъствието на електролит (изотоничен разтвор на NaCl). Реакция аглутинация протича различно в зависимост от големината на клетките, наличие на ресни, образуването на специфични антитела с различна скорост и количество.
Антигените при тази реакция се означават като аглутиногени и могат да бъдат бактериални, кръвни, тъканни или органни клетки. Антителата, които се образуват срещу бактериални и други клетки или копрускули, се означават като аглутинини и се намират в кръвния серум. Аглутинините са имуноглобулини, които се образуват в макроорганизма. Специфичното свързване на аглутиногените а аглутинините се означава като аглутинация, а образуваната впоследствие утайка аглутинат.
Аглутинацията може да бъде хомоложна – при взаимодействие на антиген с противоположно антитяло, хетероложна – при взаимодействие на близкородствени МО и съответните антитела и парааглутинация – при взаимодействие на неблизкородствените антигени и съответните антитела.
Аглутинацията зависи и от антигенната структура на бактериите. Грам / – / бактерии, които нямат ресни, проявяват само разположените във външната мембрана О-антигени. Взаимодействието им с хомоложни О-аглутинини предизвиква О-аглутинация която настъпва бавно (18 – 24 часа) и изглежда дребнозърнеста. Бактериите, които имат ресни (H-антигени), взаимодействат с хомоложни антисеруми бързо (за 2 – 3 часа) и се получава едропарцалеста H-аглутинация.
- реакция аглутинация тип Грубер – с известни антитела се доказват неизвестни антигени. Обикновено тя се провежда като ориентировъчна (пробна) реакция върху предметно стъкло. Изпълнява се при стайна температура в продължение на 1-3 min. Ако в капката на предметното стъкло, където е смесена суспензията със серума, се получи аглутинация на фона на прозрачна течност, реакция се приема за положителна. Равномерната мътност показва отрицателна реакция. Най-добре е отчитането да става на тъкмен фон или с лупа.
- реакция аглутинация тип Видал – в серума на болния се търсят антитела с известни антигени (диагностика на коремен тиф, салмонелози и др.). В няколко епруветни се приготвят разреждания на изследвания серум, след което се добавят по 1-2 капки от антигена, след което епруветките се разклащат и се поставят с термостат на 37 градуса. Предварителното отчинатане на реакцията е след 1-2 часа, а окончателното след 18-20 часа при стайна температура. За да се прецени реакцията като положителна трябва да се знаят минималните диагностични титри при различните заболявания, при които тя се използва.
- реакция коаглутинация – индентифицират се стрептококи, найсерии, салмонели и други чрез непосредствено доказване на антигените, причинители на заболявания като менингит, пневмонии и др. Методът е бърз, лесно осъществим и чувствителен. С помощта на S. aureus и познати антитела търсят непознати антигени. Тестът се извършва на предметно стъкло, като се използва капка от диагностичния препарат (сензибилизирани стафилококи с известни антитела) и една капка от изследвания материал на болен. При положителна реакция след няколко минути се появява аглутинация.
- реакция латекс-аглутинация – латексови частици са натоварени с антитела или антигени и получените диагностикуми се използват за доказване на съответно на антигени или антитела.
- реакция пасивна (непряка) аглутинация
Реакция ПРЕЦИПИТАЦИЯ
Имунна реакция при която разтворим антиген, най-често белтъчни разтвори, екзотоксини от бактерии, белтъчни разтвори от животни и др наречени преципитогени се свързват с хомоложните им антитела, наречени преципитини в присъствие на електролит при което се образува преципитата. Взаимодействието между преципитиногените и преципитинините протича с висока скорост (секунди), но е необходимо много по-продължително време за пълно утаяване на комплексите антиген-антитяло. Скоростта зависи от редица фактори: вида на антитялото, отношението антиген-антитяло в съответната смес, температурата, солевата концентрация, физичното състояние на антигена, pH и др.
Реакция преципитация е много чувствителна, открива антигени дори при разреждане 1:1 000 000 или 1 pg.
• пръстенна преципитация на Асколи – използва се при диагнозата на антракс, чума и др. Екстракт от тъканите на болно животно от антракс се надслоява в тънка епруветка върху преципитиращ серум срещу антигена на B. аnthracis. Надслоява се внимателно и се поставя в термостат При положителен резултат се получава тънка преципитационна ивица (като пръстен).
• метод на Манчини радиална имунодифузия – използва се за доказване на Ig в серума. В плака или петриева паничка с агароза се правят ямки и в тях се поставя антиген, а агарозата е с диагностичен серум, който съдържа известни антигени срещу човешки Ig.
• двойна имунодифузия по Ухтерлони – използва се предимно за качествени анализи – определяне броя на антигените в дадена смес, проверка на чистотата на някои биопрепарати, за оценка ефективността на имунизацията и др. Използва се за разпознаване на човешки и животински белтъци, в съдебната медицина и в други области на медицината.
• реакция имуноелектрофореза – комбинация между електрофореза и имунодифузия. Сместа от Аg се разделя от слаб ток електрофоретично на фракции в агаров гел. След това в агаров гел се изрязват и се поставя специфичен серум. Получават се преципитационни ивици под формата на дъга, като броя им определя броя на Аg в сместа.
• реакция неутрализация токсин-антитоксин – антитоксините се свързват с екзотоксин от бактериален произход или животински и растителни отрови (змийска, скорпиони, рицин и др.) в резултат на което се получава комплекс токсин-антитоксин. По този начин токсичността на токсина се неутрализира, но той не се разрушава. Тестът може да се извърши in vitro в агаров гел – проба на Елек при дифтерия или in vivo върху опитни животни. Най-често използвана реакция неутрализация е ACT за доказване на титъра на антителата при инфекции от sthreptococcus piogenis (ангина, фарингит, ревматизъм и др.)
Реакция за свързване на комплемента (РСК) – използва се в диагностиката за луес, коклюш, гонорея, рикетсиози, микроплазмени инфекции и при почти всички вирусни и бактериални инфекции. Антигена който може да е част от клетъчен, вирусен или друг антиген се свързва хомоложно с антитялото и образува комплекс, който свързва и активира комплемента. Ако антигена е част от клетката се лизира и настъпва хемолиза, има видим ефект. Ако антигена и е вирусен или молекулен разтвор не настъпва видим ефект от реакцията, поради това добавяме така наречената хемолитична система. Те се състои от овнешки еритроцити и хомоложните им антитела в хемолитичният серум наречен хемолизин. Тъй като няма свободен комплемент, който да лизира еритроцитите те се утаяват на дъното на епруветката. Наличието на утайка говори положителна реакция РСК, тоест в изследвания серум се откриват търсените срещи антигена антитела.
Имунофлуоресцентен метод (ИФМ) – за да се отчете реакцията срещи антигена или антитялото се свързват с флуоресцентни вещества наречени флуорохроми. Реакцията се извършва върху предметно стъкло. Има 2 варианта:
1. директен метод на Кунс – използва се за диагностика на особено опасни инфекции (антракс, чума, холера, туларемия и др.). Върху предметно стъкло се прави натривка от изследвания материал в който търсим антигена на съответния МО, натривката се накапва с антитела свързани с флуорохром. След инкубиране един час и промиване, препарата се наблюдава с флуоресцентен микроскоп. Ако има специфично светене (жълтозелено) реакцията е положителна, тоест в пробата присъства търсеният антиген, ако няма светена пробата е отрицателна.
2. индиректен непряк метод – използва се по-често, защото е приложим при повече инфекции. Предметни стъкла съдържат натривки с известен антиген, върху тях се накапва серума в който търсим антитела. Инкубира се 1 час, след това допълнително се накапва античовешки антитела конюгирани с флуорохром, инкубираме и отново промиваме, ако се наблюдава специално оцветяване реакцията е положителна, тоест в серума се съдържат търсените антитела.
Имуноензимен метод ELIZA
В тази реакция могат да се доказват антигени или антитела. Използват се плаки на дъното на ямката е фиксиран антигена, който е известен, добавя се серума в който се търсят антителата, инкубира се и се промива. Добавяне на античовешки антитела, конюгиране с ензим, инкубира се и се промива, добавя се хромогенен състав на ензима, след определено време реакцията се стопира (най-често с H2SO4) отчита се на око или със спектрофотометър. Ако реакцията е положителна се получава цветно съединения в съответната ямка.
Приложение:
1) вирусни инфекции
– хепатит А
– хепатит В – HBsAg, AbeAg, antiHBeAg, anti-HbcAg, antiHBsAg
– хепатит С
– спин HIV-1, HIV-2, antiHIV IgM
– рубеола
– херпес
2) бактериални инфекции
– лаймска болест
– сифилис
– лептоспероза
– рикетсиози
– микоплазмени инфекции
– Helicobacter pylor
– хламидин инфекция и др.
3) паразитни инфекции
– схинококоза (котешка тения)
– лаишманиоза
– токсоплазмоза
– трихинелоза
4) неинфекциозна имунология – доказване на хормони, токсини и др.
Радиоимунологични реакции. При този вид методи се определя наличието на антитела в изследвания серум с помощта на белязани с радиоактивни изотопи антигени. За отчитането на реакцията е необходима скъпа апаратура за радиоизотопно измерване, което прави метода достъпен само за по-големи лаборатории.
